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離心機的使用步驟和使用時的注意事項有哪些 ?

離心機是借離心力分離液相非均一體系的設備。根據物質的沉降系數、質量、密度等的不同,應用強大的離心力使物質分離、濃縮和提純的方法稱為離心。一般說,離心機轉速20 000r/min 以上的稱為超速離心。離心技術,特别是超速離心技術是分子生物學、生物化學研究和工業生産中不可缺少的手段。

離心機作為一種手段,具有許多優點。例如,超速離心可在低溫下操作,保護了生物大分子的活性。制備型的離心機負載量大,一次可分離提純幾克樣品,比層析、電泳上的樣品量大得多。分析離心機不僅可測物質的分子量,還可檢驗物質的純度、構象、沉降系數等。因此離心技術在生物學研究中占有重要的地位,是分離、純化細胞、病毒、蛋白、核酸和酶的最方便最有效的工具。

一、離心原理

當含有細小顆粒的懸浮液靜置不動時,由于重力場的作用使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重,下沉越快,反之密度比液體小的粒子就會上浮。微粒在重力場下移動的速度與微粒的大小、形态和密度有關,并且又與重力場的強度及液體的粘度有關。象紅血球大小的顆粒,直徑為數微米,就可以在通常重力作用下觀察到它們的

沉降過程。

此外,物質在介質中沉降時還伴随有擴散現象。擴散是無條件的絕對的。擴散與物質的質量成反比,顆粒越小擴散越嚴重。而沉降是相對的,有條件的,要受到外力才能運動。沉降與物體重量成正比,顆粒越大沉降越快。對小于幾微米的微粒如病毒或蛋白質等,它們在溶液中成膠體或半膠體狀态,僅僅利用重力是不可能觀察到沉降過程的。因為顆粒越小沉降越慢,而擴散現象則越嚴重。所以需要利用離心機産生強大的離心力,才能迫使這些微粒克服擴散産生沉降運動。

離心就是利用離心機轉子高速旋轉産生的強大的離心力,加快液體中顆粒的沉降速度,把樣品中不同沉降系數和浮力密度的物質分離開。離心力 (F) 的大小取決于離心轉頭的角速度 ( ω , r/min) 和物質顆粒距離心軸的距離 (r , cm) 。它們的關系是: F = ω 2R

為方便起見, F 常用相對離心力也就是地心引力的倍數表示。即把 F 值除以重力加速度 g ( 約等于9.8m/s2.) 得到離心力是重力的多少倍,稱作多少個 g 。例如離心機轉頭平均半徑是 6cm ,當轉速是 60 000

r/min 時,離心力是 240 000 × g ,表示此時作用在被離心物質上的離心力是日常地心引力的 24 萬倍。因此,轉速 r/min 和離心力 g 值之間并不是成正比關系,還和半徑有關。同樣的轉速,半徑大一倍,離心力 (g 值 ) 也大一倍。轉速 (r/min) 和離心力 (g 值 ) 之間的關系可用下式換算:

式中: r 為半徑 (cm) , g 為離心力 (g 值 )

二、高速離心機的離心方法

用離心方法分離生物大分子和亞細胞物質的基本原理是根據它們在液體介質中或者沉降速度不同而形成不同的區帶,或者它們的密度不同而停留在液體介質中不同的位置而把它們一一分開。前者是沉降速度法,應用該法時液體介質的最大密度要小于樣品中最小顆粒的密度,離心時選用高轉速和短時間;後者是沉降平衡法,應用該法時液體介質的最大密度要大于樣品中最小顆粒的密度,離心時選用較低轉速和較長時間。實際操作有幾種形式:

1、差速離心這種方法是選擇不同轉速的離心,分别分離各個不同組分。例如先用低速沉降大顆粒和上清液,在高速離心上清沉降中等顆粒,最後超速離心上清沉降小顆粒。采用逐級提高離心力分離上情液的方法,把不同大小的顆粒分開。

這種方法比較簡單,方便。分離的組份沉到管底,因此可以迅速濃縮所要的組份,減少體積。但回收率和純度是有矛盾的,要提高回收率,勢必提高轉速或延長離心時間,這樣大小相近的顆粒也會沉到管底。因此該法多用于粗提純或初步濃縮樣品。

2、速度區帶 ( 或速度梯度 ) 離心 本法是将樣品放在一個連續的密度梯度液體上,通過離心,大顆粒沉降快,小顆粒沉降慢。經過一段時間,相同的顆粒就在同一深度形成一條帶子,因此把各種組份分開來。它适用于分離密度相同、而大小不同的物質,如不同的蛋白質組份密度都差不多,但分子量不一樣,用本法很容易将其分

開。但對密度不同、大小類似的物質則不易分離。蔗糖梯度是一種常用的介質。用不同濃度的蔗糖溶液 (5%-60%) 配成梯度,用于梯度離心。再分别進行收集處于不同區帶裡的各個組份。

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